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[试管婴儿]冷冻胚胎的影响

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发表于 2017-9-15 14:59:59 |举报
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冷冻胚胎的影响

1972年Wilmut&Whittingham使用DMSO(Dimethyl Sulphoxide)进行使胚冷冻,以慢速冷冻及慢速解冻的方式可以 得到存活鼠胚,植入体内并可以成功形成鼠胎‧

1983年Trouson&Mohrreu将其应用至人类胚胎,成为第一例胚胎经冷冻保存解冻后产下的胎儿‧


冷冻伤害


1.冰晶

不论在冷冻任何细胞的过程中,最怕的就是细胞内的水分形成体积较大的冰晶(ice crystal),而因此破坏了细胞内的胞器、纺锤体或细胞骨架,进而影响细胞正常功能,严重时会使细胞无法存活。

(Kasai, 1996; Glenister et al., 1987)


2.最大冰晶生成带

细胞在冷冻降温时会有变化,当温度降至-1℃--5℃时,细胞内的水会结冰成冰晶,这个温带称为“最大冰晶生成带”。

冷冻速度的快慢使冰晶生成的大小不同,时间越短冰晶越小;冷冻速度越慢,通过温度时间就长,生成的冰晶就大,会刺破细胞膜,一旦解冻,细胞内溶质就会流失


3.渗透压的改变

冷冻过程水分会自细胞内渗到细胞外,因此会造成细胞内电解质的失衡因而对细胞产生伤害‧


4.温度

细胞内液体因冷冻解冻而发生相的改变,引起能量释出与温度剧烈变化,造成细胞伤害‧

目前是加入冷冻保护剂,和改善冷冻技巧‧(Rall, 1987)


5.冷冻保护剂

哺乳动物胚若无经过冷冻保护剂(cryoprotective agent, CPA)处理的情况下,是难以在低温的状况下存活。因此,适当的选择冷冻保护剂对胚的冷冻保存是非常重要的步骤。冷冻保护剂可依对细胞膜之渗透能力而分成渗透性(permeating)与非渗透性(non permeating)冷冻保护剂

 

6.渗透性冷冻保护剂

(1)毒性

(2)渗透性

(3)平衡时间

(4)温度


7.非渗透性冷冻保护剂

(1)糖类

(2)巨分子物质(macromolecules)

(3)抗冻蛋白(antifreezing protein, AFP)

(4)细胞骨架稳定剂(cytochalasin B)


以往的冷冻方法多是利用慢速冷冻(Slow freezing),方式是缓慢增加冷冻保护剂的浓度,在程式化系统梯度降温及利用『人工植冰』(seeding)控制结冰方向,使细胞外水分相对减少、电解质浓度相对增高,而逐渐置换掉细胞内的水分,使其尽量脱水,两种冷冻方法各有其优缺点‧近年由于玻璃化冷冻的研发,其解冻后胚胎的高存活率略胜一筹,目前大部分皆已全面采用玻璃化冷冻解冻技术来囊胚期胚胎。


A慢速冷冻

由于胚胎内含有水分,因此在冷冻时会形成冰晶进而造成细胞的破坏,因此在冷冻前需先进行细胞脱水。

但是当细胞脱水时,细胞内溶质的浓度亦相对增高,这对于细胞会造成不利的影响。


因此,冷冻之前的胚胎要浸泡在含有蔗糖、甘油、DMSO等冷冻保护剂中,利用低浓度慢慢增加浓度处理胚胎,逐步降低温度后,再将胚胎保存在-196℃的液态氮中。


在胚胎和冷冻保护剂达成平衡后,以电脑控制的冷冻仪让胚胎的温度缓慢的下降至-30℃左右,然后再保存于-196℃之液态氮中,就可以长期保存。在解冻时取出吸管加热,用与冷冻时相反的步骤,放回培养液中。


B玻璃化冷冻(Vitrification)

利用高浓度的冷冻保护剂,将细胞内水份脱水至细胞外,然后直接将胚胎置入-196℃的液态氮中,细胞内的物质瞬间变成高黏稠固态的玻璃状物质,细胞内冰晶形成最少的状态下冰冻起来。

解冻时直接将含胚胎的容器以37℃解冻,然后再分2至3个步骤将冷冻保护剂从细胞内移出至细胞外。


冷凍.jpg





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